植物组织培养技术自20世纪初建立以来在理论研究和应用技术上不断发展,目前已日趋完善⋯。
植物组织培养是在一个密闭的无菌微环境条件下进行的,组培苗生长的好坏与其培养条件密切相关,目前国内外对组培苗培养条件的研究主要集中在温度、光照、湿度、培养器皿、培养基成分及pH值等方面 ;而对组培苗生长所必需的气体条件研究相对较少。植物生长必须进行光合作用,光合作用离不开CO2 。认识CO2气体在组织培养中的重要性,对挖掘组织培养的生产潜力,加快试管苗生长速度和繁殖数量,培育高质量的壮苗,取得良好的经济效益均具有极其重要的意义。
1 植物对CO2的利用
植物光合作用对空气中CO2浓度有一定的要求,在一定的CO2浓度范围内,植物的光合作用强度随CO2浓度的升高而升高H 。目前大气CO2浓度为350PPM,这一浓度远远不能满足植物生长的光合所需。在一定光强时,大多数植物的CO2饱和点为800~1800 PPM,某些温室植物高达2000PPM以上。但过高的CO2浓度(4000~7000td·L 以上)会引起原生质中毒或气孔关闭而导致反作用随CO2浓度降低,植物光合作用的效率降低,直至净光合速率为零,达到CO2浓度补偿点。所谓CO2补偿点,是指在光下植物光合过程所吸收CO2 量与呼吸过程所释放CO2量达到动态平衡时环境中的CO2浓度。当外界CO2浓度处于补偿点时,植物的光合速率与呼吸速率相等,即物质收支平衡,无干物质积累;当外界Co2浓度低于补偿点时,则光合速率低于呼吸速率,植物不但不能积累光合产物,反而需要动用贮藏物质;只有在外界Co2浓度高于补偿点时,才能有效地积累干物质 。CO2 补偿点与植物同化碳素时最初阶段的CO2固定方式有关,不同植物的CO2浓度补偿点有差别,C4植物如玉米、高粱、甘蔗、苋菜等为低补偿点植物,其补偿点为0~10 PPM,如大部分农作物、蔬菜和几乎所有林木,为高补偿点植物,其补偿点为40~70 PPM 。对具有高光呼吸速率的C3植物,高CO2浓度可大幅度地提高它们的光合速率,这与高CO2 浓度能提高RuBP羧化酶活性,增强RuBP与CO2的结合能力以及抑制光呼吸对有机碳的逆转有着密切关系。C4 植物叶肉细胞中的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶与CO2有很强的亲和力,它催化PEP与cO2结合,把大气中低浓度的CO2固定下来,再通过cC3途径把CO2浓度提高并集中到维管束鞘细胞,供c3循环途径所利用 。C4植物对CO2的需求不像C3 植物那样高,其光合作用对CO2响应的敏感性相对较差,故CO2浓度的升高对C3 植物的影响要远远大于对C4 植物的影响 。
2 保护地和组织培养环境中CO2 浓度变化
2.1 保护地中C02浓度变化
保护地内CO2的浓度因保护地设施结构、管理方法、栽培作物、土壤有机质含量及天气情况等因素的不同而有所不同,但变化规律大致相同。保护地中CO2主要来自与自然界的气体交换、植物和土壤中微生物呼吸释放、土壤中有机物分解等;CO2又通过植物光合同化和与大气交换而被消耗n 。保护地是一个密闭的环境,夜间是CO2的聚集过程,在清晨未通风前浓度最高达到1000-5000PPM ;通风换气后浓度逐渐下降,由于保护地内作物种植密度高、生长势强、叶面积指数大,co2消耗速度快,到上午10时左右便降到与大气中浓度相同的程度;有时午间CO2浓度可低到70~80PPM,甚至低于作物的CO2补偿点,然而此时保护地内的温度、光照条件都比较适宜,作物的光合作用应该是一天中最强的,CO2却远远不能满足需要,成为提高光合作用的主要限制因子;直到下午4时密闭以后保护地内CO2浓度又逐渐开始回升 。保护地中CO2的缺乏使作物的生长发育迟缓,并使作物的产量、品质受到严重影响。
2.2 组培容器中CO2 浓度变化
不同培养条件下组培容器中的CO2浓度变化不同。崔瑾等试验表明:正常培养条件下,对于葡萄组培苗每天7—19时给予光照;19时熄灯后组培苗由于呼吸作用使玻璃瓶中co2浓度迅速升高,从19- 24时,CO2浓度由210PPM 上升至1800PPM。7小时开始光照,40分钟后,CO2浓度便从1500PPM 迅速下降到210PPM 的起始水平,甚至到co2补偿点。古在丰树等利用竹芋、猪笼草等不同植物和不同容积的培养容器进行试验表明:在开始光照的1~2 h内CO2浓度即由几千PPM 迅速下降到70~90 PPM,随后的光照期中都维持这种低浓度状态。到暗期又恢复到高浓度 。组织培养微环境中CO2浓度的变化与保护地中的变化极其相似(都为密闭,但在组培中的密闭条件更加严格,不同于保护地中可以放风、换气),在组培条件下生长的小苗也同样具有一定的光合能力,而光照期间组培容器中CO2得不到及时补充使得组培苗长期处于CO2饥饿状态,且组培苗长期处于高湿、弱光条件下,严重影响了光合作用,表现为组培苗较大田苗生长要细弱得多。目前组培苗长期靠培养基中的糖和人工光照进行异养和兼养生长(自养与异养同时进行) ,限制了组培苗光合生产潜力的发挥,极不利于组培苗的快速生长。
3 CO2对保护地植物和组培苗的影响
现在保护地CO2施肥技术在国内外已被广泛使甩,主要应用在蔬菜、花卉及苗木上,一般在日出后2h之内未放风时施用,浓度以800~2000PPM为宜。增施CO2已得到了很好的效果:增施CO2以加速作物生长(冠幅、高度增加、叶面积增大、叶片加厚、节间和叶柄加长、叶片气孔体积和数目增加、叶片栅栏组织比例增加、提高叶片叶绿素含量、提高细胞膜的稳定性、干物质含量增加、茎粗增加、茎干中次生木质部的生长轮加宽、材积增大、根系发达、生长加快、开花提早、花多且脱落少、生活周期缩短、提早成熟等),增加作物产量(果实种子增大),提高植物的光合速率和水分利用率,促进植物次生代谢物质的形成和分泌,增强植物抗病能力和对环境胁迫(如缺水、低光、盐害、缺肥、极端气温、空气污染等)的抵抗力,改善作物品质。。在保护地中利用CO2 还可以克服和减轻十字花科蔬菜(如花椰菜、甘蓝、萝卜、白菜等)自交不亲和系的自交不亲和性,从而无需进行人工蕾期授粉,使其自然开花授粉自交,获得原种种子,减少了大量劳力,大大降低了制种成本。另外,温室中增施CO2,,使9个月的桦树苗产生雄花序,大大缩短了林木的育种世代间隔,在强化育种方面具有很大的作用。
目前,国内外关于在组培容器中施用CO2 的研究和报道较少,崔瑾、丁永前等对“赤霞珠”葡萄组培苗的研究表明:光照期间,在容器中增施浓度为800~1200PPM Co2 后组培苗生长健壮(叶片浓绿,茎杆粗壮,茎色深红,主根长且粗,侧根多,黄白色);茎部细胞分化和植株整体发育提前(株高增长、节间距缩短、茎粗增加、茎部薄壁细胞增大、导管增粗、纤维组织开始形成、形成层明显发育、鲜重与干重均增加和叶面积增大);提高繁殖系数,光合自养能力得到促进,生长发育具有明显的优势;植株的抗倒伏和茎部输送物质的能力增强,从而使组培苗能更好地适应移栽后的外界环境,提高了植株的驯化成活率。李宗菊等对满天星组培苗的研究也得到类似的结果】。
另据报道乙烯的产生与培养基中植物激素的含量有关:培养基中生长素、细胞分裂素、吲哚乙酸、BA及KIN含量的增加可促进乙烯产生,对器官分化、繁育起抑制作用 。而CO2,可抑制乙烯的产生,延缓植株的衰老,促进植株的生长、发育。
4 CO2来源及施用技术
CO2来源一般有如下4种:(1)酒精酿造或从各种天然气中分离出的副产品:即气态CO2、液态CO2及经加工而成的固体CO2干冰 (2)化学分解:用强酸与碳酸盐作用放出CO2气体 ;(3)空气分离,即将空气低温液化蒸发分离出CO2再加温压缩成液态CO2 ;(4)碳素或碳氢化合物:如煤、焦炭、煤油液化石油气、天然气等通过充分燃烧生成CO2。国内外在CO2施用装置(环境控制技术)方面研究较少,日本的古在丰树 主要通过增加培养箱内CO2浓度,凭借箱体内CO2:浓度与培养容器内气体浓度之差,通过渗透的方式向培养容器内增施CO2。国内该领域的研究还处于起步阶段,方法与国外基本相同蚓,丁永前等自行设计制作了组培环境cO2实时增施监控系统,将组培箱与培养容器直接贯通,并在适当位置安装一个CO2传感器,即可测得组培苗周围的CO2浓度,并可根据需要随时更改CO2浓度设定值。该控制系统还能够进行培养箱内CO2 浓度的实时检测和记录,为后继的分析和研究工作提供了可靠的原始数据。
5 问题与展望
有关组培过程中增施CO2的研究,目前国内外报道较少。但在保护地适时适量增施CO2 对作物生长、质量和产量形成所起的作用已为众多研究和实践肯定。因此对与其同样处于微环境下的组培容器中增施C02的价值和意义不可忽略。实验证明,只要具有20mIn2含有叶绿素的叶片,植物就能独立进行光合作用 ;组培快繁中所使用的材料基本上为带有一段茎及一片或数片叶片的植物体,组培材料完全有能力通过自养进行生长。因此可以在培养基中不加或少加糖,通过在组培容器中增施CO2,使组培苗在无糖或少糖培养基中自养生长,实现组培的无糖或少糖培养;这不仅有利于组培无糖培养的产业化生产和降低组培苗的生产成本,还可使组培苗充分进行光合作用,通过自身的生理调节,克服组织培养中的黄化、白化、褐化、玻璃化等问题,从而起到加快组培苗生长速度和培育壮苗的目的,提高组培苗质量和移栽成活率。
目前的组培方法使用了含糖培养基,杂菌很容易侵入并在培养基中繁殖。杂菌一旦侵染,将很快在培养基上繁殖,使培养植株枯死。为了减少因杂菌污染造成的培养植物损失,必须在无菌条件下采用小型培养容器的繁杂手工接种等操作,这不利于组织培养的工厂化生产。而通过增施CO2 实现无糖培养,培养基中没有利于微生物生长的营养物质,可极大地降低污染发生率,在此情况下可用透光性好的大型培养容器替代小培养容器,使环境控制(如光照、温度、水分、养分、湿度和空气等)及接种操作简便易行,大大降低生产成本,实现工厂化生产。对于低成本、少污染的CO2碳源及更适合组培的CO2缓释颗粒有待于进一步研究;对适合于组培工厂化生产的CO2,与其它环境因子的配合使用(例如在培养基中加入一定量的稀土元素)及施用方法、施用装置和施用时期也需进一步探索。研究CO2 对组培苗的影响时,应考虑到这种影响是由CO2浓度升高造成,还是CO2浓度的变化只起到类似生长刺激素的作用。组培中增施CO2对苗体内激素的含量和变化的研究在国内外尚为空白,CO2在密闭环境中对组培苗影响的生理、生化机制研究也未见报道,建议从事这些方面的研究。另外,在组培生产中如何系统的采用自动化、新材料、节能、环保等新技术,并将系统工程学、核能学、电子工程学、材料工程学、精密仪器等学科的研究方法和成果加以应用,也是今后的研究方向。 |